Método de detección de secuencias y posibles mutaciones en secuencias largas de ADN

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Esquema de la técnica desarrollada en el que se pueden apreciar los pasos de reconocimiento (figura 1) y detección (figura 2) de secuencias y posibles mutaciones del ADN.

Dentro de los métodos de hibridación (unión de dos hebras complementarias de ADN) empleados para detectar secuencias de ADN y posibles mutaciones en el mismo, los biosensores (instrumento para la medición de parámetros biológicos) de ADN presentan ventajas frente a otros métodos como la PCR.

Una de las ventajas de estos biosensores es que permiten desarrollar dispositivos portátiles simples. Además, el acoplamiento entre dichos biosensores de ADN y las técnicas de amplificación por PCR pueden proporcionar una gran sensibilidad (capacidad para detectar concentraciones más pequeñas) para la detección de secuencias de ácidos nucleicos (ADN y ARN).

En el trabajo llevado a cabo por Tania García del grupo de investigación dirigido por la doctora Encarnación Lorenzo en el Departamento de Química Analítica y Análisis Instrumental de la UAM y publicado en la revista Analitical chemistry (Analitical chemistry (2008). 80(24); p: 9443-9449), se ha tratado de mejorar la técnica para detectar secuencias y posibles mutaciones en el ADN de muestras reales amplificadas por PCR.

La aplicación de los biosensores de ADN a muestras reales, supone el uso de secuencias de ADN de un gran número de bases, generalmente más de 100, amplificadas mediante PCR. Además de las secuencias amplificadas se pueden obtener subproductos no deseados, que puedan interferir en la medida, es decir, el uso de estas muestras reales amplificadas por PCR puede producir adsorciones inespecíficas sobre los sustratos que se usen, provocando pérdida de especificidad y sensibilidad.

Por ello, en el presente trabajo se propone una nueva metodología, para el diseño de biosensores de ADN, en la cual se separan las etapas de reconocimiento y de detección. Se propone el uso de una técnica de doble superficie, en la que la hibridación se lleva a cabo en una superficie y la detección electroquímica en otra, llamada superficie de detección.

De esta forma la etapa de reconocimiento tiene lugar en una superficie diferente a donde tendrá lugar la detección. En la etapa de reconocimiento se separa el analito del resto de los productos no deseados, de esta forma se consigue que solo este presente el analito en la etapa de detección.

La superficie de hibridación debe tener un área grande, en este sentido la utilización de nanopartículas de oro se muestra muy interesante para dicho fin. Por tanto, se ha utilizado las nanopartículas de oro como fase de reconocimiento y electrodos serigrafiados de carbono como superficie de detección.

En el estudio, además se ha testado la validez de la utilización de esta técnica de doble superficie. Para ello se ha procedido a la modificación de las nanopartículas con oligonucleótidos de cadena larga y corta (sonda) que permiten reconocer secuencias complementarias o secuencias con un desapareamiento en sus bases.

La detección del proceso de biorreconocimiento se ha llevado a cabo mediante la utilización de complejos metálicos electroquímicamente activos sobre un electrodo serigrafiado de carbono. Estos indicadores se intercalan de forma selectiva entre los pares de bases de la doble cadena de ADN, originando un cambio medible permitiendo detectar la hibridación. Se ha escogido como el más adecuado el complejo de Ru con un ligando fenantreno.

La alta sensibilidad y especificidad conseguida con el método desarrollado permite detectar, cuantificar, no sólo una secuencia corta si no también una secuencia larga, de 110 bases de ácido nucleico, y además detectar un único desapareamiento en una base de dichas secuencias. Se trata de un sistema de detección mucho más rápido y económico que los clásicos PCR.